Näin syksyn ja pimeän ajan lähestyessä on ihana muistella kesän kauniita maisemia ja kuvitella itsensä makoilemaan kukkaniitylle kasvien joukkoon. Tuuli huojuttaa auringossa kylpeviä kukkasia, pieni hyönteinen pöristelee ohi ja metsän reunassa kasvavat puut tuovat välillä mukavaa varjoa. Niityn elämä voi nopealla silmäyksellä vaikuttaa täydellisen leppoisalta.
Tarkastellaanpa tilannetta tarkemmin kasvien silmin. Kirkkaalta taivaalta porottava aurinko ei olekaan pelkästään mukava asia, vaan voimakas UV-säteily voi vahingoittaa lehtiä ja kuumuus ja kuivuus voivat lisätä stressiä. Lempeä kesätuuli saattaa kuljettaa mukanaan esimerkiksi sienitautien itiöitä. Entä jos ohi lentävä hyönteinen tekeekin U-käännöksen, laskeutuu ja munii ahnaat jälkeläisensä lehdille? Kaiken lisäksi metsän suuret puut vievät suuren osan maaperän ravinteista ja levittävät ympärilleen muille kasveille haitallisia yhdisteitä.
Oikeastaan kasvien elämä onkin melko vaarallista ja stressaavaa, eivätkä poloiset pääse edes juoksemaan karkuun! Vai ovatko ne sittenkään niin poloisia? Kasvithan ovat kehittäneet itselleen mitä mielikuvituksellisempia keinoja suojautuakseen erilaisia uhkia vastaan. Ensimmäisenä tulee tietysti mieleen piikikkäät kaktukset ja lukuisat tappavan myrkylliset lajit, mutta nämä ovat lopulta melko pienen porukan erikoisjuttuja. Eikö kaikkein mielenkiintoisimpia olisi sellaiset puolustuskeinot, joita käytännössä kaikilla kasveilla on käytössään?
No niitähän ovat tietysti kasvien (poly)fenoliyhdisteet, joista on puolustuksessa moneksi! Juuri ne pystyvät suojaamaan kasvia haitalliselta UV-säteilyltä, leviäviltä kasvitaudeilta ja nälkäisiltä kasvinsyöjiltä. Erityyppiset polyfenoliryhmät vaikuttavat kasvinpuolustuksessa eri tavoin ja näiden lukuisilla yhdistelmillä saadaan aikaiseksi todella mielenkiintoisia puolustuskuvioita. Kasvilajeja, joista näitä yhdisteitä ei löydy, saa todellakin hakemalla hakea. (Noh, sammalet ja levät näyttävät olevan aika köyhää porukkaa). Luonnollista kemiaa -hankkeen alle kuuluvan väitöskirjani ansiosta tiedämme kohta tarkasti, miltä suunnalta kasvikuntaa mitäkin polyfenoliyhdisteryhmää ja niiden aiheuttamaa puolustusaktiivisuutta kannattaa lähteä etsimään, kannattaa siis pysyä kuulolla.
Ennen kuin pääsemme käsiksi koko kasvikuntaan, selvitimme, voisiko erilaisten polyfenoliryhmien avulla muodostaa eri kasvilajeille tyypillisiä puolustussormenjälkiä, joista voisi nopealla silmäyksellä tehdä johtopäätöksiä kasvin puolustuskyvystä. Jos vielä kaikki mittaustulokset ja puolustuskyky olisivat suhteutettuna kaikkien muiden kasvien puolustuskemiaan, niin olisi mahdollista nähdä, miten eri lajit pärjäävät koko muuhun kasvikuntaan nähden.
Onnistuimme tässä tavoitteessa mielestäni aika hyvin! Tuloksena syntyi uudenlainen visuaalinen 2D-kartoitustyökalu, jossa jopa kahdeksan erilaista polyfenoliryhmää on yhdistetty niihin liittyviin bioaktiivisuuksiin kvantitatiivisesti ja kvalitatiivisesti. Kutsumme työkalua Mass spectrometric fingerprint mapping -työkaluksi. Mitä ihmettä tämä kaikki sitten tarkoittaa?
Yksinkertaistettuna tätä: kasvinäytteet on analysoitu nestegromatografi-massaspektrometriyhdistelmällä siten, että laitteisto erottaa ja tunnistaa tietyt, eri polyfenoliryhmille tunnusomaiset osat, jonka jälkeen kaikkien kyseiseen ryhmään kuuluvien yhdisteiden pitoisuus näytteessä saadaan määritettyä. Tästä muodostuu yhdisteryhmän kvantitatiivinen pitoisuus (mg/g). Eri yhdisteryhmien suora vertailu on kuitenkin haastavaa, sillä kasvi saattaa tuottaa esimerkiksi proantosyanidiinejä (PA) jopa yli 200 mg/g, kun taas flavonoleja (FL) korkeimmillaan n. 20 mg/g. Ratkaisimme kertaluokkaongelman normalisoimalla jokaisen polyfenolien pääyhdisteryhmän 0:n ja 1:n välille jokaiselle yhdisteryhmälle määritellyillä minimi- ja maksimiarvoilla. Nämä arvot määritettiin koko kasvikunnan tutkimustulosten perusteella. Näin ollaan saatu erilaiset kvantitatiiviset mittaustulokset samalle x-akselille ja vertailukelpoisiksi koko kasvikunnan kanssa.
Vaikka kasvi tuottaisi hillittömät määrät aktiivista yhdistetyyppiä, sen merkitys puolustuksessa ei välttämättä olekaan niin suuri, jos kasvi tuottaa siinä sivussa hillittömät määrät myös muita yhdisteitä. Kasvinsyöjä syö joka tapauksessa vain tietyn määrän ravintoa, eli aktiivisen yhdistetyypin osuus ravinnosta voikin olla merkityksellisempää kuin tuotettu kokonaismäärä. Esimerkiksi oksidatiivisesti aktiiviset fenolit (OX), jotka toimivat useita hyönteisherbivoreja vastaan aiheuttamalla oksidatiivista stressiä ruoansulatuskanavassa, nousee parhaimmillaan noin 50 %:iin kokonaisfenolipitoisuudesta, vaikka niiden kokonaispitoisuus olisi kasvikunnan huippuluokkaa. Samoin samaan yhdisteryhmään kuuluvien alaryhmien keskinäinen osuus voi olla todella merkityksellistä kasvinäytteen bioaktiivisuudelle, esimerkiksi hydrolysoituviin taniineihin (HT) kuuluvat ellagitanniinit (HHDP-johdannaiset) ja galloyylijohdannaiset (G) voivat suunnata kasvin bioaktiivisuutta joko oksidatiiviseen tai proteiineja saostavaan suuntaan (PPC). Tämän vuoksi halusimme ottaa työkaluumme mukaan ns. kvalitatiivisen ulottuvuuden (y-akseli), joka huomioi aktiivisten yhdisteiden osuuden kokonaisfenolipitoisuudesta ja eri polyfenolialaryhmien keskinäisen osuuden niiden yläluokasta.
Otimme työkalumme testiaineistoksi mahdollisimman erityyppisiä kasvilajeja niin biologisesta kuin kemiallisestakin näkökulmasta ja havaitsimme, että jokaisen kasvilajin sormenjälki on tunnistettavissa omakseen. Jos kasvilajien sormenjäljet muistuttivat paljon toisiaan, lisätarkkuutta saatiin tarkastelemalla flavonolijohdannaisten fragmentoitumistapaa, joka voi paljastaa, mihin kohtaan molekyyliä esimerkiksi sokeriosa on kiinnittynyt.
Seurasimme kymmentä lajia vielä kolmen vuoden ajan kolme kertaa kesässä nähdäksemme kasvukauden aikaiset ja vuosien välillä tapahtuvat muutokset. Näistä tutkimustuloksista on nyt julkaistu kaksi tuoretta artikkelia, jotka kannattaa ehdottomasti käydä lukemassa! Tarkemmat tiedot löytyvät tämän kirjoituksen lopusta.
Nyt kun työkalu testattu pienemmällä aineistolla, sitä on alettu hyödyntää koko kasvikunnan läpikäymisessä. Tiedossa on jännittäviä tuloksia, joita en paljasta ihan vielä!
Palataanpa vielä takaisin kesään ja niitylle, ja otetaan mukaan sormenjälkityökalu tuomaan uutta näkökulmaa tunnelmointiin. Tarkastellaan muutamaa mielenkiintoista esimerkkilajia.
Niityllä kasvaa kaunista violettia kyläkurjenpolvea ja metsän reunalla sen sisarlajia metsäkurjenpolvea. Näiden kahden sukulaislajin sormenjäljet muistuttavat suuresti toisiaan, mutta erojakin löytyy (Kuva 1). Molemmilla hydrolysoituviin tanniineihin (HT) kuuluvien ellagitanniinien (HHDP) suuri määrä aiheuttaa voimakasta oksidatiivista aktiivisuutta. Toisiaan muistuttavien lajien suurimmat erot aiheutuvat flavonolien ja kviinihappojohdannaisten (QA) eroista sekä metsäkurjenpolven pienestä proantosyanidiiniyhdisteiden (PA, sis. PC ja PD) määrästä. Jos katsotaan vielä tarkemmin flavonolisormenjälkiä (FL, sis. KA, QU, MY), kahden lajin erot ovat ilmeisiä. Mikähän voisi olla syynä näille eroille? Kenties erilainen kasvuympäristö erilaisine valo- ja lämpötilaeroineen ja kasvinsyöjineen?
Kuva 1. Ylhäällä kyläkurjenpolvi ja alhaalla sen sukulaislaji metsäkurjenpolvi (A), sormenjälkikartta, jossa on mukana kahdeksan yhdisteryhmää (ympyrät) ja kaksi bioaktiivisuutta (neliöt) (B) ja flavonolisormenjäljet molemmille lajeille (C). Vaikka lajit ovat läheistä sukua toisilleen, sormenjälkikarttojen avulla nähdään, miten niiden polyfenolikemia eroaa toisistaan.
Metsässä kasvaa myös toisenlaisia ellagitanniineja tuottavia jykeviä tammia, joiden oksidatiivinen aktiivisuus on huippuluokkaa, vaikka HT-pitoisuus onkin matalampi kuin kurjenpolvilla (Kuva 2). Tämä paljastaa sen, että myös ellagitanniinityypillä on merkitystä. Näitä tarkempia rakenteita voimme tarvittaessa tarkastella erikseen kaivamalla esiin alkuperäiset kromatogrammit ja UV- ja massaspektrit. Mitään tietoa ei siis olla hukattu matkan varrella, vaikka sormenjälkityökalu hieman yksinkertaistaakin dataa.
Kuva 2. Sormenjälkikartoissa on tiivistetty valtavasti kemiallista informaatiota, jota voidaan tarpeen tullen tarkastella yksityiskohtaisemmin. Tammen (A) sormenjälkikartasta (B) voidaan havaita poikkeuksellisen vahva oksidatiivinen aktiivisuus (mustat neliöt). UV- ja MS-kromatogrammeja (C) ja yksittäisten yhdisteiden spektrejä (D) tarkastelemalla voidaan helposti tunnistaa useita ellagitanniineihin kuuluvia yhdisteitä, joista bioaktiivisuus johtuu.
Metsän reunassa kasvaa myös punaviinimarjaa muistuttavia taikinamarjapensaita, joilla näyttää myös olevan melko tehokas oksidatiiviseen aktiivisuuteen perustuva puolustusvalmius (Kuva 3). Niiden polyfenolisormenjälki on kuitenkin täysin toisenlainen. Niiden prodelfinidiinipitoisuus (PD) ja osuus proantosyanidiineista on poikkeuksellisen korkea, kuten myös myrisetiinijohdannaisten (MY) osuus flavonoleista. Itse asiassa meidän kotoisa taikinamarjamme on PD:n osuuden ja määrän suhteen koko kasvikunnan parhaimmistoa.
Kuva 3. Taikinamarjan (A) sormenjälkikartta (B) kertoo, että laji tuottaa runsaasti prodelfinidiinirikkaita (siniset ympyrät) proantosyanidiineja, jotka nostavat oksidatiivista aktiivisuutta (mustat neliöt).
Täysin toisenlaista bioaktiivisuutta edustaa lähistöllä kasvava vaahtera. Sen sormenjälkikartasta näemme poikkeuksellisesti vain galloyylijohdannaisia emmekä lainkaan ellagitanniineja (Kuva 4). Myös oksidatiivinen aktiivisuus on lähes minimissä, mutta proteiininsaostuskyky todella korkealla. Taustalta paljastuu erityinen galloyylijohdannaisten ryhmä gallotanniinit, jotka ovat kasvikunnassa jokseenkin harvinaisia. Miksiköhän vaahtera on yksi näistä harvoista gallotanniinilajeista?
Kuva 4. Vaahteran (A) sormenjälkikartassa (B) erottuu voimakas proteiininsaostuskyky (valkoiset neliöt) joka aiheutuu galloyylijohdannaisiin (vihreät ympyrät) kuuluvista gallotanniineista.
Lähempi tarkastelu osoittaa, että kasvit eivät ole vain paikallaan kyhjöttäviä raukkoja, vaan ne ovat pystyneet kehittämään hyvin monipuolista kemiaa suojakseen. Ainakin biologille tämä kaikki herättää valtavan määrän mielenkiintoisia kysymyksiä eri yhdisteryhmien kehityksen syistä. Mitä vastaan kasvit puolustautuvat tuottamillaan yhdisteillä? Mitkä historialliset ympäristötekijät ovat pakottaneet kehittämään uusia puolustuskeinoja? Miksi kaikki lajit eivät ole päätyneet samanlaisiin puolustusratkaisuihin? Mitä tapahtuu esimerkiksi ilmaston lämpenemisen seurauksena, kun alueen vanha kasvillisuus joutuu kohtaamaan uusia herbivoreja? Kuinka vahvasti puolustuskemia linkittyy tiettyihin kasviryhmiin? Näiden kysymysten parissa voisi viettää loppuikänsä, mutta ennen kuin mennään asioiden edelle, kirjoittaja jatkaa tärkeää pohjatyötä koko kasvikunnan (huh!) polyfenoliryhmien parissa.
Suvi
Väitöskirjatutkija, joka kulkee läpi kasvien evoluutiohistorian yrittäen samalla keksiä, mitä matkalla on tapahtunut, jotta yli 10 000 polyfenoliyhdistettä on syntynyt
Vanhakylä, S.; Salminen, J.-P. 2023. Mass Spectrometric Fingerprint Mapping Reveals Species-Specific Differences in Plant Polyphenols and Related Bioactivities. Molecules 28 (17), 6388. https://doi.org/10.3390/molecules28176388
Vanhakylä, S.; Salminen, J.-P. 2023. Seasonal Variation in Plant Polyphenols and Related Bioactivities Across Three Years in Ten Tree Species as Visualized by Mass Spectrometric Fingerprint Mapping. Molecules 28 (16), 6093. https://doi.org/10.3390/molecules28166093